Знаймо

Додати знання

приховати рекламу

Цей текст може містити помилки.

Полімеразна ланцюгова реакція



План:


Введення

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - експериментальний метод молекулярної біології, що дозволяє домогтися значного збільшення малих концентрацій певних фрагментів нуклеїнової кислоти ( ДНК) в біологічному матеріалі (пробі).

Крім ампліфікації ДНК, ПЛР дозволяє проводити безліч інших маніпуляцій з нуклеїновими кислотами (введення мутацій, зрощення фрагментів ДНК) і широко використовується в біологічній і медичній практиці, наприклад, для діагностики захворювань (спадкових, інфекційних), для встановлення батьківства, для клонування генів, виділення нових генів.


1. Історія

На початку 1970-х років норвезькому вченому Хьелл Клеппе з лабораторії нобелівського лауреата Хара Гобіндом Хоран прийшла в голову думка, що можна ампліфікувати ДНК за допомогою пари коротких одноланцюгових молекул ДНК - синтетичних праймерів [1]. Однак, у той час ця ідея залишилася нереалізованою. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) була відкрита в 1983 році американським біохіміком Кері Мулліс. Його метою було створення методу, який би дозволив ампліфікувати ДНК в ході багаторазових послідовних подвоєнь вихідної молекули ДНК за допомогою ферменту ДНК-полімерази. Перша публікація за методом ПЛР з'явилася в листопаді 1985 року в журналі Science [2]) Через 8 років після цього, за винахід методу ПЛР, К. Мулліс отримав Нобелівську премію [3].

На початку використання методу після кожного циклу нагрівання - охолодження доводилося додавати в реакційну суміш ДНК-полімеразу, так як вона інактивувати при високій температурі, необхідної для розділення ланцюгів спіралі ДНК. Процедура проведення реакції була порівняно неефективною, вимагала багато часу і ферменту. В 1986 метод полімеразної ланцюгової реакції був істотно покращено. Було запропоновано використовувати ДНК-полімерази з термофільних бактерій [4]. Ці ферменти виявилися термостабільність і були здатні витримувати безліч циклів реакції. Їх використання дозволило спростити і автоматизувати проведення ПЛР. Одна з перших термостабільних ДНК-полімераз була виділена з бактерій Thermus aquaticus і названа Taq-полімеразою. Недолік цієї полімерази полягає в тому, що ймовірність внесення помилкового нуклеотиду в неї досить висока, тому що в цього ферменту відсутні механізми виправлення помилок (3 '→ 5' екзонуклеазная активність). Полімерази Pfu і Pwo, виділені з архей, мають такий механізмом, їх використання значно зменшує число мутацій в ДНК, але швидкість їх роботи (процессівность) нижче, ніж у Taq. Зараз застосовують суміші Taq і Pfu, щоб домогтися одночасно високій швидкості полімеризації і високої точності копіювання.

У момент винаходу методу Кері Малліс працював хіміком-синтетики (він синтезував олігонуклеотиди, які застосовувалися тоді для виявлення точкових мутацій по гібридизації з геномної ДНК) в компанії Цетус (en: Cetus Corporation), яка і запатентувала метод ПЛР. В 1992 Цетус продала права на метод і патент на використання Taq-полімерази компанії Хофман-Ла Рош за 300 млн доларів. Однак виявилося, що Taq-полімераза була охарактеризована радянськими біохіміками А. Каледіним, А. Слюсаренко і С. Городецьким в 1980 році [5], а також, за 4 роки до цієї радянської публікації, тобто в 1976 році, - американськими біохіміками Alice Chien, David B. Edgar і John M. Trela. [6] У зв'язку з цим компанія Промега (Promega) намагалася в судовому порядку змусити Рош відмовитися від виняткових прав на цей фермент [7]. Американський патент на метод ПЛР минув у березні 2005 р.


2. Проведення ПЛР

Метод заснований на багаторазовому виборчому копіюванні певної ділянки ДНК за допомогою ферментів в штучних умовах ( in vitro). При цьому відбувається копіювання тільки тієї ділянки, яка задовольняє заданим умовам, і лише в тому випадку, якщо він присутній в досліджуваному зразку. На відміну від ампліфікації ДНК в живих організмах, ( реплікації), за допомогою ПЛР амплифицируют відносно короткі ділянки ДНК. У звичайному ПЛР-процесі довжина копійованих ДНК-ділянок становить не більше 3000 пар основ (3 kbp [8]). За допомогою суміші різних полімераз, з використанням добавок і за певних умов довжина ПЛР-фрагмента може досягати 20-40 тисяч пар нуклеотидів. Це все одно значно менше довжини хромосомної ДНК еукаріотичної клітини. Наприклад, геном людини складається приблизно з 3 млрд пар основ [9].


2.1. Компоненти реакції

Для проведення ПЛР у найпростішому випадку потрібні наступні компоненти:

  • ДНК-матриця, що містить ту ділянку ДНК, який потрібно ампліфікувати.
  • Два праймера, комплементарні протилежним кінців різних ланцюгів необхідного фрагмента ДНК.
  • Термостабільна ДНК-полімераза - фермент, який каталізує реакцію полімеризації ДНК. Полімераза для використання в ПЛР повинна зберігати активність при високій температурі тривалий час, тому використовують ферменти, виділені з термофілів - Thermus aquaticus (Taq-полімераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полімераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полімераза) та інші.
  • Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
  • Іони Mg 2 +, необхідні для роботи полімерази.
  • Буферний розчин, що забезпечує необхідні умови реакції - рН, іонну силу розчину. Містить солі, бичачий сироватковий альбумін.

Щоб уникнути випаровування реакційної суміші, в пробірку додають висококиплячі масло, наприклад, вазелінове. Якщо використовується ампліфікатор з підігріває кришкою, цього робити не потрібно.

Додавання пірофосфатази може збільшити вихід ПЛР-реакції. Цей фермент каталізує гідроліз пірофосфату, побічного продукту приєднання нуклеотідтріфосфатов до зростання ланцюга ДНК, до ортофосфата. Пірофосфат може інгібувати ПЛР-реакцію [10].


2.2. Праймери

Специфічність ПЛР заснована на утворенні комплементарних комплексів між матрицею і праймерами, короткими синтетичними олігонуклеотиди довжиною 18-30 основ. Кожен з праймерів комплементарний одному з ланцюгів двуцепочечной матриці і обмежує початок і кінець ампліфіціруемого ділянки.

Після гібридизації матриці з праймером (відпал [11]), останній служить затравкою для ДНК-полімерази при синтезі комплементарної ланцюга матриці (див. нижче).

Найважливіша характеристика праймерів - температура плавлення (T m) комплексу праймер-матриця.

T m - температура, при якій половина ДНК-матриць утворює комплекс з олігонуклеотидних праймером. Температуру плавлення можна приблизно визначити за формулою T_m = 2 \ cdot (n_A + n_T) +4 \ cdot (n_G + n_C) , Де n X - кількість нуклеотидів Х в праймера.

У разі невірного вибору довжини і нуклеотидного складу праймера або температури відпалу можливе утворення частково комплементарних комплексів з іншими ділянками матричної ДНК, що може привести до появи неспецифічних продуктів. Верхня межа температури плавлення обмежений оптимумом температури дії полімерази, активність якої падає при температурах вище 80 C.

При виборі праймеров бажано дотримуватися наступних критеріїв:

  • GC-складу ~ 40-60%;
  • близькі T m праймерів (відмінності не більш, ніж на 5 C);
  • відсутність неспецифічних вторинних структур - шпильок [12] і димерів [13];
  • бажано, щоб на 3'-кінці був гуанін або цитозин, оскільки вони утворюють три водневі зв'язки з молекулою матриці, роблячи гібридизацію більш стабільною.

2.3. Ампліфікатор

Рис. 1: ампліфікатор для проведення ПЛР

ПЛР проводять в ампліфікатора - приладі, що забезпечує періодичне охолодження і нагрівання пробірок, зазвичай з точністю не менше 0,1 C. Сучасні ампліфікатора дозволяють задавати складні програми, у тому числі з можливістю "гарячого старту", Touchdown ПЛР (див. нижче) і подальшого зберігання ампліфікованих молекул при 4 C. Для ПЛР у реальному часі випускають прилади, обладнані флуоресцентним детектором. Існують також прилади з автоматичною кришкою і отвором для мікропланшет, що дозволяє вбудовувати їх в автоматизовані системи.


3. Хід реакції

Світлина гелю, що містить маркерну ДНК (1) і продукти ПЛР-реакції (2, 3). Цифрами показана довжина фрагментів ДНК в парах нуклеотидів

Зазвичай при проведенні ПЛР виконується 20-35 циклів, кожен з яких складається з трьох стадій (рис. 2).

3.1. Денатурація

Двухцепочечную ДНК-матрицю нагрівають до 94-96 C (або до 98 C, якщо використовується особливо термостабільна полімераза) на 0,5-2 хв., Щоб ланцюга ДНК розійшлися. Ця стадія називається денатурацією, так як руйнуються водневі зв'язки між двома ланцюгами ДНК. Іноді перед першим циклом (до додавання полімерази) проводять попереднє прогрівання реакційної суміші протягом 2-5 хв. для повної денатурації матриці і праймерів. Такий прийом називається гарячим стартом, він дозволяє знизити кількість неспецифічних продуктів реакції.


3.2. Відпал

Коли ланцюга розійшлися, температуру знижують, щоб праймери могли зв'язатися з одноцепочечной матрицею. Ця стадія називається відпалом. Температура відпалу залежить від складу праймерів і зазвичай вибирається на 4-5 С нижче їхні температури плавлення. Час стадії - 0,5-2 хв. Неправильний вибір температури відпалу приводить або до поганого зв'язування праймерів з матрицею (при завищеною температурі), або до зв'язування в невірному місці і появі неспецифічних продуктів (при заниженій температурі).

3.3. Елонгація

ДНК-полімераза реплицирует матричну ланцюг, використовуючи праймер як затравки. Це - стадія елонгації. Полімераза починає синтез другого ланцюга від 3'-кінця праймера, який зв'язався з матрицею, і рухається вздовж матриці в напрямку від 3 'до 5'. Температура елонгації залежить від полімерази. Часто використовувані полімерази Taq і Pfu найбільш активні при 72 C. Час елонгації залежить як від типу ДНК-полімерази, так і від довжини ампліфіціруемого фрагмента. Звичайний час елонгації приймають рівним одній хвилині на кожну тисячу пар основ. Після закінчення всіх циклів часто проводять додаткову стадію фінальної елонгації, щоб добудувати всі одноланцюжкові фрагменти. Ця стадія триває 7-10 хв.

Рис. 2: Схематичне зображення першого циклу ПЛР. (1) Денатурація при 94-96 C. (2) Відпал при 68 C (наприклад). (3) Елонгація при 72 C (P = полімераза). (4) Закінчено перший цикл. Дві отримані ДНК-ланцюга служать матрицею для наступного циклу, тому кількість матричної ДНК в ході кожного циклу подвоюється.

Кількість специфічного продукту реакції (обмеженого праймерами) теоретично зростає пропорційно 2 n, де n - число циклів реакції. Насправді ефективність кожного циклу може бути менше 100%, тому насправді P ~ (1 + E) n, де P - кількість продукту, Е - середня ефективність циклу.

Число "довгих" копій ДНК теж зростає, але лінійно, тому в продуктах реакції домінує специфічний фрагмент.

Зростання необхідного продукту в геометричній прогресії обмежений кількістю реагентів, присутністю інгібіторів, освітою побічних продуктів. На останніх циклах реакції зростання сповільнюється, це називають "ефектом плато" [14].


4. Різновиди ПЛР

  • "Вкладена" ПЛР (Nested PCR (Англ.) ) - Застосовується для зменшення числа побічних продуктів реакції. Використовують дві пари праймерів і проводять дві послідовні реакції. Друга пара праймерів амплифицируют ділянку ДНК усередині продукту першої реакції.
  • "Інвертована" ПЛР (Inverse PCR (Англ.) ) - Використовується в тому випадку, якщо відомий лише невелику ділянку всередині потрібної послідовності. Цей метод особливо корисний, коли потрібно визначити сусідні послідовності після вставки ДНК в геном. Для здійснення інвертованою ПЛР проводять ряд розрізання ДНК рестриктазами з подальшим з'єднанням фрагментів ( лігування). У результаті відомі фрагменти виявляються на обох кінцях невідомого ділянки, після чого можна проводити ПЛР як звичайно.
  • ПЛР із зворотною транскрипцією ( Reverse Transcription PCR, RT-PCR (Англ.) ) - Використовується для ампліфікації, виділення або ідентифікації відомої послідовності з бібліотеки РНК. Перед звичайної ПЛР проводять на матриці мРНК синтез одноцепочечной молекули ДНК за допомогою ревертази і отримують одноцепочечную кДНК, яка використовується в якості матриці для ПЛР. Цим методом часто визначають, де і коли експресуються дані гени.
  • Асиметрична ПЛР ( англ. Asymmetric PCR ) - Проводиться тоді, коли потрібно ампліфікувати переважно одну з ланцюгів вихідної ДНК. Використовується в деяких методиках секвенування і гібрідізаціонних аналізу. ПЛР проводиться як завжди, за винятком того, що один з праймерів береться у великому надлишку.
  • Кількісна ПЛР (Quantitative PCR, Q-PCR (Англ.) ) - Використовується для швидкого вимірювання кількості певної ДНК, кДНК або РНК в пробі.
  • Кількісна ПЛР у реальному часі (Quantitative real-time PCR) - в цьому методі використовують флуоресцентно мічені реагенти для точного вимірювання кількості продукту реакції у міру його накопичення.
  • Touchdown (Stepdown) ПЛР (Touchdown PCR (Англ.) ) - За допомогою цього методу зменшують вплив неспецифічного зв'язування праймерів на освіту продукту. Перші цикли проводять при температурі вище температури відпалу, потім кожні декілька циклів температуру знижують. При певній температурі система пройде через смугу оптимальної специфічності праймерів до ДНК.
  • Метод молекулярних колоній (ПЛР в гелі, англ. Colony - PCR Colony ) - акріламідний гель полімеризують з усіма компонентами ПЛР на поверхні і проводять ПЛР. У точках, що містять аналізовану ДНК, відбувається ампліфікація з утворенням молекулярних колоній.
  • ПЛР з швидкою ампліфікацією решт кДНК ( англ. Rapid amplification of cDNA ends, RACE-PCR )
  • ПЛР довгих фрагментів ( англ. Long-range PCR ) - Модифікація ПЛР для ампліфікації протяжних ділянок ДНК (10 тисяч підстав і більше). Використовують дві полімерази, одна з яких - Taq-полімераза з високою процессівностью (тобто, здатна за один прохід синтезувати довгий ланцюг ДНК), а друга - ДНК полімераза з 3'-5 'екзонуклеазной активністю. Друга полімераза необхідна для того, щоб коригувати помилки, внесені першою.
  • RAPD PCR ( англ. Random Amplification of Polymorphic DNA PCR , ПЛР з випадковою ампліфікацією поліморфної ДНК - використовується тоді, коли потрібно розрізнити близькі по генетичній послідовності організми, наприклад, різні сорти культурних рослин, породи собак або близькоспоріднені мікроорганізми. У цьому методі зазвичай використовують один праймер невеликого розміру (близько 10 п.н.). Цей праймер буде частково комплементаріїв випадковим ділянкам ДНК досліджуваних організмів. Підбираючи умови (довжину праймера, його склад, температуру тощо), вдається домогтися задовільного відмінності картини ПЛР для двох організмів.
  • PCR з використанням гарячого старту ( англ. Hot-start PCR - Модифікація ПЛР з використанням парафіну для поділу верхній (яка містить буферний розчин, полімеразу, матрицю і, якщо необхідно, деіонізованої воду) і нижньої (яка містить деіонізованої воду, праймери і дезоксірібонуклеотіди) сумішей з метою недопущення раннього змішування компонентів реакції. До початку реакції ампліфікатор необхідно прогріти до температури плавлення парафіну (60-80 C).

Якщо нуклеотидних послідовність матриці відома частково або невідома зовсім, можна використовувати вироджені праймери, послідовність яких містить вироджені позиції, в яких можуть розташовуватися будь-які підстави. Наприклад, послідовність праймера може бути такою: ... ATH ..., де Н - А, Т або С.


5. Застосування ПЛР

ПЛР використовується в багатьох областях для проведення аналізів і в наукових експериментах.

5.1. Криміналістика

ПЛР використовують для порівняння так званих "генетичних відбитків пальців". Необхідний зразок генетичного матеріалу з місця злочину - кров, слина, сперма, волосся і т. п. Його порівнюють з генетичним матеріалом підозрюваного. Досить зовсім малу кількість ДНК, теоретично - однієї копії. ДНК розщеплюють на фрагменти, потім амплифицируют за допомогою ПЛР. Фрагменти розділяють з допомогою електрофорезу ДНК. Отриману картину розташування смуг ДНК і називають генетичним відбитком пальців ( англ. genetic fingerprint ).


5.2. Встановлення батьківства

Рис. 3: Результати електрофорезу ДНК-фрагментів, ампліфікованих за допомогою ПЛР. (1) Отець. (2) Дитина. (3) Мати. Дитина успадкував деякі особливості генетичного відбитку обох батьків, що дало новий, унікальний відбиток.

Хоча "генетичні відбитки пальців" унікальні (за винятком випадку однояйцевих близнят), родинні зв'язки все ж таки можна встановити, зробивши декілька таких відбитків (рис. 3). Той же метод можна застосувати, злегка модифікувавши його, для встановлення еволюційного спорідненості серед організмів.


5.3. Медична діагностика

ПЛР дає можливість істотно прискорити і полегшити діагностику спадкових і вірусних захворювань. Потрібний ген амплифицируют за допомогою ПЛР з використанням відповідних праймерів, а потім секвеніруют для визначення мутацій. Вірусні інфекції можна виявляти відразу після зараження, за тижні чи місяці до того, як виявляться симптоми захворювання.

5.4. Персоналізована медицина

Іноді ліки виявляються токсичними або алергенними для деяких пацієнтів. Причини цього - почасти в індивідуальних відмінностях у сприйнятливості і метаболізмі ліків та їх похідних. Ці відмінності детермінуються на генетичному рівні. Наприклад, у одного пацієнта певний цитохром (білок печінки, що відповідає за метаболізм чужорідних речовин) може бути більш активний, в іншого - менш. Для того, щоб визначити, який різновидом цитохрому володіє даний пацієнт, запропоновано проводити ПЛР-аналіз перед застосуванням ліків. Такий аналіз називають попередніми генотипування ( англ. prospective genotyping ).


5.5. Клонування генів

Клонування генів (не плутати з клонуванням організмів) - це процес виділення генів і, в результаті генноінженерних маніпуляцій, отримання великої кількості продукту даного гена. ПЛР використовується для того, щоб ампліфікувати ген, який потім вставляється в вектор - фрагмент ДНК, який переносить чужорідний ген в той же самий чи інший, зручний для вирощування, організм. Як векторів використовують, наприклад, плазміди або вірусну ДНК. Вставку генів в чужорідний організм зазвичай використовують для отримання продукту цього гена - РНК або, найчастіше, білка. Таким чином у промислових кількостях отримують багато білків для використання в сільському господарстві, медицині та ін

Рис. 4: Клонування гена з використанням плазміди.
(1) Хромосомна ДНК організму A. (2) ПЛР. (3) Безліч копій гена організму А. (4) Вставка гена в плазміду. (5) Плазміда з геном організму А. (6) Введення плазміди в організм В. (7) Множення кількості копій гена організму А в організмі В.

5.6. Секвенування ДНК

У методі секвенування з використанням мічених флуоресцентною міткою або радіоактивним ізотопом дідезоксінуклеотідов ПЛР є невід'ємною частиною, так як саме в ході полімеризації в ланцюг ДНК вбудовуються похідні нуклеотидів, мічені флуоресцентної або радіоактивною міткою. Це зупиняє реакцію, дозволяючи визначити положення специфічних нуклеотидів після поділу синтезованих ланцюжків в гелі.

5.7. Мутагенез

В даний час ПЛР стала основним методом проведення мутагенезу (внесення змін до нуклеотидну послідовність ДНК). Використання ПЛР дозволило спростити і прискорити процедуру проведення мутагенезу, а також зробити її більш надійною і відтворної.

Примітки

  1. Kleppe, K. et al. (1971): Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases. In: J. Mol. Biol. Bd. 56, S. 341-361. PMID 4927950
  2. Saiki RK, Scharf S., Faloona F., Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Science 1985 Dec 20; 230 (4732): 1350-4; Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.
  3. Нобелівські лауреати з хімії, 1993 р. (Англ.) - Nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993 /
  4. RK Saiki, DH Gelfand, S. Stoffel, SJ Scharf, R. Higuchi, GT Horn, KB Mullis, HA Erlich. Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase - sunsite.berkeley.edu/cgi-bin/ebind2html/pcr/009. in: Science. 239.1988, 487-491. ISSN 0036-8075 - PMID: 2448875
  5. Каледін А. С., Слюсаренко А. Г., Городецький С. І. / / Біохімія. - 1980. - T. 45. - C. 644-651.
  6. Alice Chien, David B. Edgar і John M. Trela. Deoxyribonucleic Acid Polymerase from Extreme Thermophilic Thermus aquaticus. Jourmal of Bacteriology, Sept. 1976, pp. 1550-1557.
  7. Roche - Roche announces settlement agreement with Promega - www.roche.com/med-cor-2005-09-12
  8. 1 kbp (kilo base pair (Англ.) ) - 1 тисяча пар основ, одиниця виміру довжини ДНК
  9. Venter J, et al. (2001). "The sequence of the human genome". Science 291 (5507): 1304-51. PMID 11181995
  10. http://www.biofidal.com/biofidal2/cat/2/pyro.php - www.biofidal.com/biofidal2/cat/2/pyro.php
  11. Відпал ( англ. annealing ) - Гібридизація фрагментів ДНК
  12. Шпилька - внутримолекулярная самокомплементарная структура
  13. Димер - міжмолекулярні структури, утворені праймерами один з одним або самі з собою
  14. http://www.dna-technology.ru/doc/DNA-Technology_PCR-base.pdf - www.dna-technology.ru/doc/DNA-Technology_PCR-base.pdf "Теоретичні основи ПЛР" (PDF)

Література

  1. Глік Б., Пастернак Дж. Молекулярна біотехнологія. Принципи та застосування. Пер. з англ. - М.: Мир, 2002. - 589 с., Іл. - ISBN 5-03-003328-9
  2. Патрушев Л. І. Штучні генетичні системи. - М.: Наука, 2005. - У 2 т. - ISBN 5-02-033278-X
  3. Щелкунов С. Н. Генетична інженерія. - К.: Сиб. універ. вид-во, 2004. - 496 с.; Іл. - ISBN 5-94087-098-8

Цей текст може містити помилки.

Схожі роботи | скачати

Схожі роботи:
Ланцюгова реакція
Ланцюгова ядерна реакція
Ланцюгова лінія
Ланцюгова гомотопий
Хімічна реакція
Реакція Вюрца
Політична реакція
Реакція Вассермана
Термоядерна реакція
© Усі права захищені
написати до нас
Рейтинг@Mail.ru