Гібридизація ДНК

Гібридизація ДНК, гібридизація нуклеїнових кислот - з'єднання in vitro комплементарних одноланцюгових нуклеїнових кислот в одну молекулу. При повній комплементарності об'єднання відбувається легко і швидко, а в разі часткової некомплементарни злиття ланцюжків сповільнюється, що дозволяє оцінити ступінь комплементарності. Можлива гібридизація ДНК-ДНК і ДНК-РНК.


1. Протокол експерименту

  1. Дволанцюжкові ДНК розігрівають у відповідному буфері. Через зміни зовнішніх умов, водневі зв'язки між комплементарними азотистими підставами стають термодинамічно невигідними і ланцюжки розходяться.
  2. Препарат денатурованих ДНК змішують з іншого денатурованої ДНК.
  3. Препарати повільно охолоджують, при цьому одноцепочечниє ДНК гибрідизуючою один на одного (утворюються водневі зв'язки між комплементарними підставами), при цьому утворюється "гібридна" молекула ДНК.

Аналіз швидкості відпалу (= гібридизації) одноланцюгових ДНК дозволяє оцінювати подібності та відмінності в послідовностях ДНК між видами або особинами одного виду.


2. Обчислення температури плавлення ДНК

Вторинна структура ДНК відіграє важливу роль у біології, генетичної діагностики і інших методів молекулярної біології і нанотехнології. Тому, точне визначення температури плавлення ДНК або РНК молекул відіграє найголовнішу роль у всіх молекулярно-біологічних методах, наприклад, як підбір проб або олігонуклеотидів для мікрочіпів або для підбору ПЛР праймерів. Існує декілька простих формул обчислення температури плавлення для коротких олігонуклеотидів. Грубе обчислення температури плавлення (T m) короткого олигонуклеотида (<20 нуклеотидів) проводять за прямим підрахунком кількості нуклеотидів (G+ C - сума всіх гуанін і цитозин, L - довжина олигонуклеотида):

T_m = 2 (L + G+ C) , [1]

Усереднена формула підрахунку T m для короткого олигонуклеотида (і для довгих ДНК фрагментів), з урахуванням концентрації іонів K + і DMSO :

T_m = 77.1 +11.7 \ lg [K ^ +] + \ frac {41 (G+ C) - 528} {L} -0.75 [% DMSO] , [2]

Однак, ці рівняння не враховують ініціацію зв'язування при гібридизації олігінуклеотіда, не враховують особливості самої послідовності та кінцевого ефекту, характерний для олігонуклеотидних дуплексів. Тому, дана формула придатна в більшому ступені, де послідовність ДНК усереднена і довжина дуплексів понад 40 нуклеотидів.


3. ДНК термодинаміка

Найбільш поширений метод використовується сьогодні для розрахунку температури плавлення дволанцюжкової або одноцепочечной ДНК, заснований на двоступеневу термодинамічної моделі. Дві комплементарні ДНК молекули А і В, або вони пов'язані один з одним або вільні у розчині ("random coil state"). Зазвичай вважається, що обидві молекули А і В повністю комплементарні, тому очевидна їх гібридизація, а також дозволені одна або декілька помилок комплементарності в дуплекс, в тому числі припустимі і некомплементарни GG, GT і GA пари ( wobble pairs). У разі ж тільки однією молекулу, передбачається упаковка її в петлеву структуру. Процес гібридизації в дуплекс описується формулою:

A + B \ longleftrightarrow AB

де А і В різні ланцюги в розчині ("random coil state"), і АВ освічена дуплекс. Дана реакція оборотна. Константа рівноваги k, для цієї реакції визначається як: k = \ frac {[AB]} {[A] [B]} .

Константа рівноваги залежить від концентрації ланцюгів, від температури, концентрації солей, рН та інших компонентів в реакції (наприклад, гліцерин або DMSO). Константа До змінюється у відповідь на зміну концентрації однієї або обох ланцюгів ([At] і / або [Bt]), тоді вся система відповідає на зміни і тоді індивідуальні концентрації [A], [B] і [AB] теж зміняться. Наприклад, якщо в системі більше ланцюга А, то концентрація [AB] збільшиться. Припустимо, константа рівноваги дорівнює 1.81x10 6 і концентрація ланцюгів [At] = [Bt] = 10 -5 M:

k = 1.81 \ cdot 10 ^ 6 = \ frac {[AB]} {[A] [B]}

[At] = 10 ^ {-5} M = [A] + [AB]

[Bt] = 10 ^ {-5} M = [B] + [AB]

Підставляємо компоненти в формули для обчислення k :

k = \ frac {[AB]} {([A] - [AB]) ([Bt] - [AB])}

k = 1.81 \ cdot 10 ^ 6 = \ frac {[AB]} {[A] [B]}

1.81 \ cdot 10 ^ 6 = \ frac {[AB]} {(10 ^ {-5} - [AB]) (10 ^ {-5} - [AB])}

Після перестановки отримуємо:

O = k [AB] ^ 2 - \ frac {k [At] + k [Bt] + 1} {[AB] + k [At] [Bt]}

O = aX ^ 2 + bX + c

де [AB] = X = \ frac {\ pm b \ sqrt (b ^ 2-4ac)} {2a} .


Наприклад, підставити в цю формулу [AB] = 7.91x10 -6 M тоді концентрацію ланцюгів складе [A] = [B] = 2.09x10 -6 M. Тобто тільки 79% [At] ланцюгів буде зв'язані в дуплекс [AB].

Чи можливо визначити константи рівноваги при зміні температури? Це підводить нас до розуміння важливих термодинамічних параметрах як вільної енергії (dG), ентальпія (dH) і ентропія (dS). Зміни вільної енергії, ентальпія і ентропія відбуваються при переході від "температурі Т гібридизації" до безладного, випадковому станом. Ці відносини визначаються формулою dG = dH TdS, (для концентрації ланцюгів [A] = [B] = [AB] = 1M), тоді ідеальна формула для обчислення вільної енергії Гіббса:

dG_T ^ 0 = \ frac {dH ^ 0-TdS ^ 0} {1000}

де T температура в кельвінах, dH (cal / mol) і dS (cal / mol K).

Існує корисне співвідношення, що зв'язує зміна вільної енергії Гіббса в ході хімічної реакції за її константою рівноваги:

dG_T ^ 0 =-RT \ cdot \ ln (k)

де R - універсальна газова стала (1.987cal/mol K).

Комбінуючи обидві формули отримуємо:

T = \ frac {dH ^ 0} {dS ^ 0-R \ ln (k)}

Температура плавлення (T m) визначається при рівновазі, коли половину ланцюгів пов'язані один з одним і інша половина перебуває у вільному стані, тобто k = 1:

T = \ frac {dH ^ 0} {dS ^ 0} -273.15

Температуру плавлення для простої петлі розраховують як T_m (K) = \ frac {dH ^ 0} {dS ^ 0} . Для ДНК дуплексу необхідно враховувати концентрацію кожної ланцюга (в молях, М). Таким чином, якщо [A] і [B] концентрації молекул А і В, то загальна концентрація ланцюгів, C дорівнює їх сумі, [A] + [B].

Передбачається, що концентрація обох ланцюгів однакова [A] = [B] = C / 2. У такому випадку,

T_m (K) = \ frac {dH ^ 0} {dS ^ 0 + R \ cdot \ ln (\ frac {C} {f})}

де f = 4. Для самокомплементарного олигонуклеотида [A 0] = C і тоді і f = 1. Дана температура плавлення визначається тільки в разі, коли половина молекул пов'язані один з одним.

Для самокомплементарного олигонуклеотида, k = 1 / [At] тому:

T_m = \ frac {dH ^ 0} {dS ^ 0 + R \ ln ([At])} -273.15

Для не комплементарного дуплекса, коли [At] ≥ [Bt], k = 1 / ([At] - [Bt] / 2), Tm обчислюють так:

T_m = \ frac {dH ^ 0} {dS ^ 0 + R \ ln ([At] - \ frac {[Bt]} {2})} -273.15

де [At] молярна концентрація переважної ланцюга (як правило ПЛР праймер), а [Вt] молярна концентрація ланцюга з низькою концентрацією (геномна ДНК).


4. Обчислення температури плавлення

Термодинамічні параметри dG, dH і dS розраховуються на основі моделі найближчих сусідів (nearest neighbour). Для точного прогнозування вторинної структури ДНК при гібридизації з використанням динамічних алгоритмів програмування потрібно база даних по всіх можливих термодинамічних параметрах для кожної комплементарної пари підстав, а також для для всіх варіантів при не співпадаючих нуклеотидів, для вільних кінців, шпильок і петель. Термодинамічна формула обчислення короткого олигонуклеотида грунтується на термодинамічних параметрах - ентропії dS і ентальпії dH, для кожної з 10 варіантів поєднань чотирьох нуклеотидів (Таблиця 1). У Таблиці 1 представлені термодинамічні параметри для найближчих сусідів (NN) для пар нуклеотидів при концентрації 1М NaCl.

Для підрахунку Tm ( С) здійснюється підсумовування всіх значень вільної енергії Гіббса для кожної пари з кроком один нуклеотид:

dG общая = dG начальное + dG симетрия +∑dG + dG AT конец

5'-CGTTGA-3 ' = DG початкове + dG симетрии + CG + GT + TT + TG + GA + AT кінець
3'-GCAACT-5 ' GC CA AA AC CT

dG теоретична = 1.96 + 0 - 2.17 - 1.44 - 1.44 - 1.00 - 1.45 - 1.30 +0.05

dG теоретична = -5.35 kcal / mol

Аналогічно підраховуються значення ентропії (dH = -43.5 kcal / mol) і ентальпії (dS = -122.5):

T_m = \ frac {-43.5 \ cdot1000} {-122.5 +1.9872 \ ln (\ frac {0.0004} {4})} -273.15 = 35.8

Багато ДНК дуплекси мають конкуруючі однонітевиє структури, і це зрушує рівновазі системи і як результат зниження значення T m від передбачуваною формулою значення.

Загальна формула для обчислення T m з корекцією на сіль в розчині:

T_m = \ frac {dH \ cdot1000} {dS + R \ ln (\ frac {C} {4}) +0.386 (L-1) \ ln ([K ^ +])} -273.15

де L - довжина олигонуклеотида, R - газова постійна (1.987cal / K mol), c - концентрація олигонуклеотида в (зазвичай 2x10 -7 M), [K +] - концентрація іонів калію в молях (зазвичай 5x10 -2 M).


Таблиця 1. Термодинамічні параметри для ближайщего сусідів (NN) для пар нуклеотидів при концентрації 1М NaCl [3], [4]
Послідовність пар
(5'-3 '/ 3'-5')
\ Delta H
kcal / mol
\ Delta S
cal / (mol K)
\ Delta G 37
kcal / mol
AA / TT -7.6 -21.3 -1.00
AT / TA -7.2 -20.4 -0.88
TA / AT -7.2 -20.3 -0.58
CA / GT -8.5 -22.7 -1.45
GT / CA -8.4 -22.4 -1.44
CT / GA -7.8 -21.0 -1.28
GA / CT -8.2 -22.2 -1.30
CG / GC -10.6 -27.2 -2.17
GC / CG -9.8 -24.4 -2.24
GG / CC -8.0 -19.9 -1.84
ініціація +0.2 -5.7 +1.96
концевая AT пара +2.2 +6.9 +0.05
корекція на симетрію 0.0 -1.4 +0.43

5. Одиночна помилка всередині дуплексу

Модель найближчих сусідів для комплементарних нуклеотидних пар може розширений для пари, що включають некомплементарни нуклеотиди. Було показано, що існує тенденція зменшуюча стабільність не комплементарних пар основ в порядку убування:

GC> AT> G G> G T ≥ G A> T T ≥ A A> T C ≥ A C ≥ C C

Гуанідин G є найбільш "нерозбірливим" підставою, оскільки він утворює сильний пари підстав та з некомплементарни підставами (G G, G T і G A). З іншого боку, цитозин C є найбільш дискримінаційним підставою, оскільки він утворює найстабільніші комплементарні пари і нестійкі пари з некомплементарни підставами (T C ≥ A C ≥ C C) [5], [6].


Примітки

  1. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K (1979). " Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to phi chi 174 DNA: the effect of single base pair mismatch - dx.doi.org/10.1093/nar/6.11.3543 ". Nucleic Acids Res 6 (11): 3543-57. DOI : 10.1093/nar/6.11.3543 - dx.doi.org/10.1093/nar/6.11.3543.
  2. Nicolas von Ahsen, Carl T. Wittwer, Ekkehard Schtz (2001). " Oligonucleotide melting temperatures under pcr conditions: nearest-neighbor corrections for Mg 2 +, deoxynucleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide concentrations with comparison to alternative empirical formulas - www.clinchem.org/content/47/11/1956.full ". Clinical Chemistry 47 (11): 1956-1961.
  3. SantaLucia JJ, Hicks D (2004). " The thermodynamics of DNA structural motifs - dx.doi.org/10.1146/annurev.biophys.32.110601.141800 ". Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure 33. DOI : 10.1146/annurev.biophys.32.110601.141800 - dx.doi.org/10.1146/annurev.biophys.32.110601.141800.
  4. SantaLucia JJ (1998). " A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics - dx.doi.org/10.1073/pnas.95.4.1460 ". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (4): 1460-1465. DOI : 10.1073/pnas.95.4.1460 - dx.doi.org/10.1073/pnas.95.4.1460. PMID 9465037.
  5. Peyret N, Seneviratne PA, Allawi HT, SantaLucia JJ (1999). " Nearest-neighbor thermodynamics and NMR of DNA sequences with internal AA, CC, GG, and TT mismatches - dx.doi.org/10.1021/bi9825091 ". Biochemistry 38: 3468-3477. DOI : 10.1021/bi9825091 - dx.doi.org/10.1021/bi9825091.
  6. Allawi HT, SantaLucia JJ (1997). " Thermodynamics and NMR of internal GT mismatches in DNA - dx.doi.org/10.1021/bi962590c ". Biochemistry (36): 10581-10594. DOI : 10.1021/bi962590c - dx.doi.org/10.1021/bi962590c.